RNA干扰是什么?关于RNA干扰的详细介绍

创闻科学2020-11-16 15:57:53

RNA干扰(RNAi)是RNA分子通过中和靶向mRNA分子来抑制基因表达或翻译的生物学过程。历史上,RNAi还有其他名字,包括共抑制,转录后基因沉默(PTGS),以及平息。对这些看似不同的过程的详细研究表明,这些现象的本质都是RNAi。安德鲁·法尔和克雷格·梅洛在1998年首先在秀丽隐杆线虫中发现了RNA干扰现象并发表论文,并因此获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。自从发现RNAi及其在调节基因表达中的作用以来,RNAi已经在抑制目标基因等方面展现出巨大的潜力。RNAi现在被认为是精确、高效、稳定的基因抑制技术,优于反义寡核苷酸技术。

两种小核糖核酸分子–微小核糖核酸 (miRNA)和小干扰核糖核酸 ( siRNA )–是RNA干扰的核心。RNA是基因的直接产物,这些小RNA可以诱导酶复合物降解信使RNA (mRNA)分子,从而通过转录后基因沉默阻止翻译降低其活性。此外,小RNA还可以通过转录前沉默机制抑制基因表达,通过这种机制,酶复合物可以在基因组中与siRNA或miRNA互补匹配的位置催化DNA甲基化。RNA干扰在保护细胞免受病毒和转座子等寄生核苷酸序列的攻击方面起着重要作用。RNA干扰也在影响生物发育过程中扮演重要角色。

RNAi途径存在于许多真核生物中,包括动物,这一机制由酶Dicer 启动,该酶将长双链RNA (dsRNA) 分子切割成约21 核苷酸的短双链片段 siRNA .每个 siRNA 解链成两个单链RNA,正义链和反义链。正义链降解,反义链并入 RNA诱导沉默复合体 (RISC)。在反义链与信使RNA分子中的互补序列配对后,RISC中的催化成分,Argonaute 2 (Ago2), 负责将mRNA切成碎片。这一过程的结果便是转录后基因沉默。由于切割后反义链可以从RISC解离并重复利用,在一些生物中,即便初始siRNA浓度很低,这一沉默效应也会级联放大甚至影响整个个体。

RNAi在细胞实验和活体动物实验中都是一种有价值的研究工具,因为根据序列互补匹配设计的合成dsRNA可以引入细胞,并可以选择性地和直接地诱导对特定基因的抑制。通过系统性地沉默特定基因,RNAi技术可以用于大规模筛选某个特定的细胞过程(如分裂)所需的基因。此外,RNAi在生物技术、医学和杀虫剂中也有许多实际的应用。

细胞机理

提取自肠道贾第鞭毛虫的Dicer蛋白质结构,Dicer负责催化将dsRNA切割成siRNA.图中绿色为核糖核酸酶结构域,黄色为PAZ结构域,红色为平台结构域,蓝色为连接螺旋。

RNAi是一种依赖RNA的基因沉默,这一过程发生在细胞质中,由短双链RNA分子引发,受RNA诱导沉默复合体(RISC)控制,然后由RISC中具备催化功能的Argonaute完成。当dsRNA是外源性的(来自RNA病毒感染或实验室操作)时,RNA被直接导入细胞质,并被Dicer切割成短片段。起始dsRNA也可以是内源性的(来源于细胞),如在基因组中由 RNA编码基因表达的pre-miRNA。来自这些基因的初级转录产物首先在细胞核中被加工并形成pre-miRNA的特征性茎环结构,然后被输出到细胞质中。因此,外源性和内源性两条dsRNA路径在RISC处汇聚。

外源dsRNA通过激活核糖核酸酶蛋白Dicer启动RNAi,Dicer在植物中剪切双链RNA(dsRNA),在人类中剪切短发夹RNA (shRNA),以产生20-25个碱基长度的双链RNA片段。该片段在3’端有两个悬空的未成对核苷酸。 生物信息学对多种生物基因组的研究表明,这个长度最大限度地提高了针对目标基因的特异性,并将脱靶效应降至最低。这些短双链片段被称为小干扰核糖核酸( siRNA)。然后,这些siRNA被解链成单股RNA,并由RISC加载复合体(RLC)整合到一个活性RISC复合体中。RLC包括Dicer-2和R2D2,它们对联合Ago2和RISC至关重要。TATA结合蛋白相关因子11 (TAF11)通过促进Dcr-2-R2D2四聚化组装RLC,这一过程将siRNA的结合亲和力增加了10倍。R2-D2与TAF11结合后,形成RLC复合体。携带多个双链RNA结合结构域的R2D2负责识别siRNA的热力学稳定末端,而Dicer-2负责识别siRNA较不稳定的另一端。Ago2加载siRNA的过程也是不对称的:Ago2的MID结构域优先识别siRNA热力学稳定的一端。于是,正义链因5’端无法被MID结构域识别而被丢弃,只有反义链与Ago结合并最终形成RISC复合体。

集成到RISC后, siRNA 碱基对与它们的目标mRNA结合并导致其被降解,从而阻止其被用作翻译模板。与 siRNA 不同,装载miRNA的RISC复合物扫描细胞质mRNA以寻找潜在的互补性。miRNA不会通过Ago2直接降解mRNA,而是通常以不完全互补的方式与mRNA的3’-UTR结合,从而阻止mRNA进入核糖体翻译。

外源dsRNA要先被效应蛋白识别并结合方能引发Dicer活性,这一效应蛋白在线虫中为RDE-4, 在果蝇中则为R2D2.目前尚不明确为何只产生特定长度(20-25个碱基对)的siRNA,而效应蛋白只结合长双链RNA。

在线虫中,这一初始反应通过合成一系列次级siRNA被放大,这些次级siRNA是以Dicer剪切后的初级siRNA为模板合成的。这些次级siRNA与初级siRNA结构不同,它们似乎是由RdRP酶合成的。

MicroRNA

来自羽衣甘蓝的pre-miRNA二级结构

微小RNA 是一种由基因组编码的非编码RNA ,用以调节基因表达,尤其是在发育过程中。广义的RNA干扰现象包括内源的miRNA诱导的基因沉默效应以及外源dsRNA触发的沉默。成熟的miRNAs在结构上与由外源性dsRNA产生的siRNA相似,但在成熟之前,miRNA必须首先经历广泛的转录后修饰。在miRNA形成的过程中,首先,一个更长的RNA编码基因转录出被称作pri-miRNA的初级转录产物,然后pri-miRNA在细胞核的微处理器复合体中加工成70个核苷酸长度的茎环结构,即pre-miRNA。这个复合物由一种叫做Drosha 的第III类核糖核酸酶 和一种叫DGCR8的dsRNA结合蛋白组成。pre-miRNA的双链部分被Dicer结合和切割,从而形成可以被整合到RISC复合体中的成熟miRNA分子;因此,miRNA和 siRNA 具有相同的下游细胞机制。

来自长dsRNA前体的siRNA与miRNA的不同在于,miRNA,特别是动物中的miRNA,通常与mRNA之间形成不完全的碱基互补配对,从而抑制许多序列相似但不完全相同的mRNA的翻译。而相比之下,典型的siRNA通常只和碱基序列完全互补匹配的mRNA配对,并只诱导单一的mRNA降解。在果蝇秀丽隐杆线虫中,miRNA和 siRNA 由不同的argonaute蛋白和dicer酶处理。

3’-UTR和miRNA

信使核糖核酸(mRNA) 的3'-UTR通常包含可以导致转录后沉默的调控序列。这种3’-UTR通常包含两种结合位点,一种结合miRNA, 另一种结合调节蛋白。通过结合3’-UTR内的特定位点,miRNAs可以通过抑制翻译或直接导致mRNA降解来降低各种mRNA的基因表达。3'-UTR也可以包含抑制蛋白的结合位点,这些蛋白可以直接阻止mRNA表达。

3’-UTR通常包含miRNA响应元件(MREs) 。MRE是miRNA结合的序列。这些是3’-UTRs中主要的序列。在3’-UTRs的所有调控序列中(例如沉默区),MRE占大约一半。

截至2014年,miRBase 网站,一个miRNA序列和注释的数据库,列出了233个生物物种中的28645个miRNA。其中,1881个miRNA位于人类miRNA基因组中。据预测,每个miRNA平均有大约400个目标mRNA(影响数百个基因的表达)。弗里德曼等人估计,人类mRNA 3’UTRs中有超过45000个miRNA靶点在进化上保守,并且超过60%的人类蛋白编码基因在选择压力下仍具备与miRNA的配对能力。

直接实验表明,单个miRNA可以降低数百个不同的mRNA的稳定性。其他实验表明,单个miRNA可以抑制数百种蛋白质的产生,但这种抑制通常相对温和(不到2倍)。

miRNA失调对基因表达的影响在癌症中似乎很重要。例如,在胃肠癌中,九种微小核糖核酸被鉴定为表观遗传学改变并有效下调了DNA修复酶。

miRNA失调对基因表达的影响似乎在神经精神障碍中也很重要,如精神分裂症、双相情感障碍、重度抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默病和自闭症谱系障碍。

RISC活化和催化

外源dsRNA要先被效应蛋白识别并结合方能引发Dicer活性,这一效应蛋白在线虫中为RDE-4, 在果蝇中则为R2D2. 这种蛋白质只结合长双链RNA,但目前尚不明确为何只产生特定长度(20-25个碱基对)的siRNA。然后,这种RNA结合蛋白促进切割后的 siRNA 的转移到RISC复合体中。

在线虫中,这一初始反应通过合成一系列次级siRNA被放大,这些次级siRNA是以Dicer剪切后的初级siRNA为模板合成的。这些次级siRNA与初级siRNA结构不同,它们似乎是由RdRP酶合成的。

小RNA 生物发生:初级miRNAs (pri-miRNAs)在细胞核中转录,并折叠成发夹,然后由微处理器复合体在细胞核中修剪,形成约60-70nt发夹前RNA。这种前miRNA通过核孔复合体 (NPC)转运到细胞质中,在那里Dicer 进一步将其修剪成约20nt miRNA双链(前SiRNA也在这一步进入通路)。然后,双链miRNA被加载到Ago中,形成“前RISC(RNA诱导沉默复合体)”,并释放正义链,形成活化的 RISC 。

左:来自一种古细菌——火红球菌的Argonaute全长结构。右:Argonaute蛋白和双链RNA结合的PIWI结构域。

RNA诱导沉默复合体(RISC)的活性成分是一种被称作Argonaute蛋白的核酸内切酶,这种内切酶可切割与siRNA互补配对的mRNA。由于dicer产生的片段是双链的,理论上每条链都可以作为一个有功能的 siRNA 。然而,这两条链中只有一条链,即反义链,可以结合argonaute蛋白并指导基因沉默。另一条链,即正义链,则在RISC活化时被降解。虽然最初认为依赖三磷酸腺苷的解旋酶分离了这两条链,该过程后来被证明与ATP无关,而是直接由RISC的蛋白质组分完成。然而,通过在生化实验中比较ATP存在或不存在的情况下的RNAi过程,动力学分析表明,mRNA在被剪切后从RISC复合物上解链并脱离可能需要ATP。反义链通常是5’端互补配对不太稳定的那条链,但决定哪条链是反义链这个过程和Dicer从哪个方向切割dsRNA无关。然而,R2D2蛋白可以通过结合5’端更稳定的正义链决定哪条链作为反义链被加载入RISC复合体。

通过使用X射线晶体衍射观察结合了RNA的Argonaute蛋白的结合结构域,Argonaute与RNA结合的结构生物学基础得以被了解。在这一结构中,RNA被磷酸化的5’端进入到一个进化上保守的碱性口袋中,并通过一个二价氧离子(例如镁离子)或π-π相互作用与一个进化上保守的酪氨酸接触。该位点被认为是siRNA与mRNA靶标结合的成核位点。通过研究5’或3’的碱基错配对这一过程的抑制作用,结果表明,反义链的5’端可能负责寻找和结合目标mRNA,而3’端负责引导mRNA以最佳姿态进入RISC复合体的剪切结构域。

尚不清楚活化的RISC复合物如何在细胞内定位互补的mRNA。虽然切割过程被认为与翻译相关,但目标mRNA的翻译对于RNAi介导的降解不是必需的。事实上,RNAi可能对未翻译的mRNA更有效。Argonaute蛋白质定位于细胞质中被称为处理小体的特定区域(也称为细胞质体或GW体),而这些区域恰恰是mRNA衰减率高的区域;miRNA过程也集中在处理小体。干扰处理小体降低了RNA干扰的效率,表明它们是RNAi过程中的一个关键位点。

转录沉默

dicer 修剪双链核糖核酸,形成小干扰核糖核酸或微小核糖核酸。这些经过处理的RNA被整合到 RNA诱导沉默复合体 (RISC)中,RISC以信使RNA 为目标,并阻止其被翻译。[44]

许多真核生物利用RNA干扰通路中的组成部分维持其基因组的组织和结构。组蛋白修饰和在其诱导下形成的异染色质导致基因在转录前被下调;这个过程被称为 RNA诱导的转录沉默 (RITS),由一个称为RITS复合物的蛋白质复合物执行。在裂殖酵母中,该复合物包含argonaute、一种色域蛋白Chp1和一种功能未知的被称为Tas3的蛋白质。因此,异染色质区的诱导和扩散需要argonaute和RdRP蛋白。事实上,裂殖酵母中这些基因的敲除会影响组蛋白甲基化和着丝粒的形成,导致细胞在分裂后期出现缓慢或停滞。在另一些情况下,类似的与组蛋白修饰相关的过程又能上调基因转录。

RITS复合物诱导异染色质形成和组织的机制尚不清楚。大多数研究集中在裂变酵母中的交配型区域,这可能无法代表其他基因组区域/生物体中的活性。在维持已有的异染色质区时,RITS与和局部基因互补的siRNA形成复合物,并稳定结合局部甲基化的组蛋白,以共转录的方式降解由RNA聚合酶生成的任何新生pre-miRNA。异染色质区的形成需要Dicer参与,而维持异染色质区不需要,这可能是因为用来靶向目标RNA的初始互补配对的siRNA需要Dicer才能形成。异染色质维持被认为是一个自我增强的反馈回路,用来整合到局部RITS复合物中的新siRNA是由RdRP以偶然出现的新生RNA为模板合成的。这些在裂殖酵母交配型区域和着丝粒中的观察是否适用于哺乳动物尚不清楚,因为哺乳动物细胞中异染色质的维持可能不依赖RNA干扰通路的组成部分。

与RNA编辑之间的相互影响

在高等真核生物中,最普遍的RNA编辑是ADAR(作用于RNA的腺嘌呤脱氨酶)将RNA中的A(腺苷)转化为I(肌苷)的这一过程。在2000年,有研究者首先指出,RNA干扰和腺嘌呤脱氨作用可能竞争同一个双链RNA底物。一些pre-miRNA也会经历腺嘌呤脱氨型RNA编辑。这种机制可以调控成熟miRNA的处理和表达。另外,至少一种哺乳动物的ADAR可以中和RNA干扰途径中的siRNA。对敲除ADAR的线虫的研究进一步支持了这一结论,即腺嘌呤脱氨型RNA编辑可以抵消RNAi对内源基因或转基因的沉默。

植物和动物中RNA干扰的异同。天然表达的微小核糖核酸或外源的小干扰核糖核酸经dicer 处理并整合到介导基因沉默的RISC 复合物中。[60]

不同生物中的RNA干扰

生物体利用外源dsRNA并将其用于RNAi途径的能力各不相同。在植物和线虫中,RNA干扰产生的影响是全身性的且可遗传,但在哺乳动物和果蝇中却不是这样。在植物中,RNAi被认为通过胞间连丝(细胞壁中允许通信和运输的通道)在细胞之间传递。RNA干扰的可遗传性来自由RNA干扰导致的启动子甲基化,因为新的甲基化模式可以传给每一代子细胞。植物和动物之间的一个广泛的普遍区别在于内源产生的miRNAs的靶向性;在植物中,miRNAs通常与它们的靶基因完全或几乎完全互补,并诱导RISC直接切割mRNA,而动物的miRNAs往往在序列上不那么严格互补,并诱导翻译抑制。这种翻译抑制效应是通过阻碍翻译起始因子和mRNA的poly(A)尾结合来实现的。

一些真核原虫,例如利什曼原虫克鲁兹锥虫完全缺乏RNAi途径。一些真菌也缺少大部分或全部的RNA干扰机制,最显著的是模式生物 酿酒酵母。然而,RNA干扰却存在于其他芽殖酵母,例如卡氏酵母和白色念珠菌中,进一步实验证明,向酿酒酵母中引入两个来自卡氏酵母的基因就可以使其获得RNA干扰途径。某些子囊菌和担子菌缺失RNA干扰途径的事实表明,许多不同的真菌谱系都在各自独立的进化中丢失了RNA干扰所需的蛋白,这可能是由于它们进化出了具有类似功能的新途径,或者在某些微环境中保留RNA干扰途径并不具备显著的选择优势。

与原核生物的关系

原核生物的基因表达受一个与RNA干扰有些相似的RNA系统的影响。在原核生物中,RNA编码基因通过产生一段可以和mRNA互补配对并结合的RNA来控制特定mRNA的翻译或数量。然而,这些RNA通常被认为不属于miRNA, 因为这一过程没有Dicer的参与。有人认为原核生物中的CRISPR干扰系统类似于真核RNA干扰系统,尽管它们的蛋白质成分都不是同源的。

生物功能

免疫

RNA干扰是对病毒和其他外来遗传物质的免疫反应的重要组成部分,特别是在植物中,它也可以阻止转座子的自我扩增。拟南芥等植物表达多种dicer同源基因,这些同源基因在植物接触不同病毒时发生不同的反应。早在RNAi途径被完全理解之前,就已知植物中诱导的基因沉默可以在整个植物中系统地扩散,并且可以通过嫁接从砧木转移到接穗植物。这种现象后来被认为是植物适应性免疫系统的一个特征,从而在局部感染病毒之后引发植物整体的免疫反应。相应地,许多植物病毒进化出复杂的机制来抑制RNAi。这其中包括一种可以利用单链RNA(由Dicer产生)的未成对一端与双链RNA片段结合的病毒蛋白质。一些植物基因组也表达内源的 siRNA 作为对特定类型细菌感染的反应。这些效应可能是对病原体普遍反应的一部分,通过下调宿主中任何有利于病原体的代谢过程来控制感染。

尽管动物通常比植物表达更少的dicer酶变体,但RNA干扰也会在一些动物中引发抗病毒反应。无论是幼年还是成年果蝇,核糖核酸干扰在抗病毒先天免疫中都很重要,并对病原体如果蝇X病毒具有抗病毒活性。在线虫中RNA干扰可能也有类似的免疫学功能,例如线虫在病毒感染时Argonaute蛋白的表达会上调,而过表达RNA干扰相关的蛋白质可以使线虫对病毒产生免疫力。

RNA干扰在哺乳动物先天免疫中的作用尚不清楚,也没有太多相关实验数据。然而,编码能够抑制哺乳动物细胞中RNAi反应的基因的病毒的存在,可能是支持存在依赖RNAi的哺乳动物免疫反应的证据,尽管这一现象被认为并非是假设成立的充分条件。有证据表明哺乳动物细胞中存在一种功能性抗病毒RNAi途径。

哺乳动物病毒中RNAi也存在其他功能,例如由疱疹病毒表达的miRNA,它可以触发异染色质区形成来介导病毒潜伏。

基因下调

内源性表达的miRNAs,包括内含子和基因间 miRNA,在翻译抑制和发育调控中发挥着重要作用,特别是在调控形态发生的时间和维持未分化的或不完全分化的细胞(如干细胞)方面。内源表达的miRNA在下调基因表达中的作用在1993年首次在秀丽隐杆线虫中被发现。在植物中,这种功能是通过观察“JAW miRNA”调控拟南芥的形态控制基因时发现的。在植物中,大多数受miRNAs调控的基因是转录因子;因此miRNA的活性范围特别广泛,在发育过程中通过调节关键的调控基因的表达来调节整个基因网络,这些调控基因包括转录因子和 F-box蛋白。在包括人类在内的许多生物体中,miRNAs与肿瘤的形成和细胞周期的失调有关。miRNA有时扮演抑癌基因的角色,有时又是致癌基因。

基因上调

与启动子部分互补的RNA序列( siRNA 和miRNA)可以促进基因转录,这种现象被称为 RNA活化。这一过程的部分机理是已知的,比如该过程有Dicer和Argonaute蛋白参与,而这一过程可能是通过组蛋白去甲基化实现的。miRNAs被认为在细胞周期停止时通过未知的机制上调其靶基因。

进化

基于简约法 系统发育分析,所有真核生物的最近共同祖先很可能已经拥有早期RNA干扰途径;在某些真核生物中缺乏这种途径被认为是一个后出现的特征。这个古老的RNAi系统可能包含至少一种dicer样蛋白、一种argonaute、一种 PIWI 蛋白和一种 RNA复制酶,它们也可能发挥了其他细胞作用。一项大规模的比较基因组学研究同样表明真核生物的冠群已经拥有这些组分,这些组分可能在一开始与更广泛的RNA降解系统(如外泌体)有某种功能上的关联。这项研究还表明,与RNA结合的argonaute蛋白家族在真核生物、大多数古菌和至少一些细菌(例如Aquifex aeolicus),与翻译起始系统的组件同源并最初从其进化而来。

RNAi系统祖先的功能通常被认为是用来产生防御外源性基因组分的免疫反应,比如针对转座子和病毒基因组。组蛋白修饰等相关功能可能已经存在于现代真核生物的祖先中,而miRNA的其他功能,如调节发育等,被认为是后来进化的。

作为许多真核生物抗病毒先天免疫系统的组成部分,RNA干扰基因参与了与病毒基因之间的进化军备竞赛。一些病毒已经进化出抑制宿主细胞中RNAi反应的机制,特别是植物病毒。对果蝇进化速率的研究表明,RNAi通路中的基因具有很强的方向性选择,是果蝇基因组中进化最快的基因之一。

应用

基因敲低

在实验生物学中经常利用RNA干扰途径来研究基因在细胞培养和模型生物体内的功能。与感兴趣的基因互补配对的双链RNA可以在体外合成,然后导入细胞或生物体内,并激活RNA干扰途径。利用这一原理,研究人员可以大幅度降低目标基因的表达。通过研究特定基因被敲低后的表型变化,研究者可以弄清楚一个特定基因的生理功能。由于RNAi可能不会完全消除基因的表达,这种技术有时被称为“敲低”,以区别于基因表达完全消除的“敲除”过程。在最近的一项研究中,使用基因阵列数据验证RNAi沉默效率表明,429个独立实验中,RNA干扰敲除基因的失败率为18.5%。

在计算生物学领域,许多研究集中在如何设计可以最大限度敲低目标基因,同时又最小化脱靶效应的双链RNA上。当引入的RNA具有可以与多个基因配对的碱基序列,就会出现脱靶效应。这种效应在双链RNA包含重复序列时尤为常见。对人类、秀丽隐杆线虫和摇尾隐杆线虫的基因组研究表明,大约10%的siRNA都存在显著的脱靶效应。研究人员开发了很多软件,这些软件通过引入适用于所有生物,适用于哺乳动物和适用于病毒 的不同算法,可以自动预测siRNA在不同生物中潜在的脱靶效应。

根据实验对象生物的不同,外源RNA可以是将会在细胞内被Dicer进一步切割的长双链RNA,也可以是能被直接作为siRNA底物使用的短链RNA。在大多数哺乳动物细胞中,使用较短的RNA是因为较长的双链RNA分子会诱导哺乳动物的干扰素反应,这一反应是一种对外源遗传物质的非特异性免疫反应。小鼠卵母细胞和早期小鼠胚胎细胞缺乏这种对外源性dsRNA的反应,因此是研究哺乳动物基因敲除效应的常见模型系统。另外,还可以通过间接引入siRNA来提高哺乳动物中RNA干扰的效率,例如可以通过导入能编码siRNA序列的质粒实现对细胞的稳定转染,或者通过引入更复杂的、可以在适当条件下诱导激活或失活的慢病毒载体系统,来实现所谓的“条件性RNA干扰”。

功能基因组学

正常的成年果蝇,RNAi实验中常用的模式生物。

秀丽隐杆线虫果蝇是研究动物中的RNAi效应最常用的模式生物。线虫经常被用于RNAi研究有两个主要原因,一是线虫中的基因沉默效应通常是可遗传的,二是对线虫导入双链RNA极其简单。通过一种尚不明确的机制,细菌(如大肠杆菌)可以通过线虫的肠道将双链RNA高效递送到线虫体内。这种“喂食递送”在诱导基因沉默方面与更昂贵更耗时的递送方法一样有效,例如将线虫浸泡在dsRNA溶液中或将dsRNA注射到性腺中。虽然在大多数其他生物体中递送RNA更困难,但人们还是在哺乳动物细胞模型中利用RNA干扰开展了许多研究大规模基因组功能的工作。

设计全基因组RNAi文库的方法可能比设计一个siRNA来满足一组确定的实验条件更加复杂。人工神经网络常被用于设计 siRNA 文库并预测它们在基因敲除时的可能效率。大规模基因组筛选被广泛认为是一种有前途的基因组注释方法,并促进了基于微阵列的高通量筛选方法的发展。然而,这些在模式生物(例如秀丽隐杆线虫)上开发的筛选方法能否推广到其他生物,哪怕是邻近物种(例如其他寄生线虫),仍然是一个很大的疑问。

在植物基因组图谱和基因组注释等植物功能基因组学研究中,RNAi是一种很受欢迎的技术,因为许多植物是多倍体,这对更传统的基因工程方法是一个很大的挑战。例如,RNAi已经成功地用于面包小麦(六倍体)以及更常见的植物模型系统拟南芥和玉米的功能基因组学研究中。

医学

RNAi用于医学的历史 File:Vertical Timeline of RNAi's Use in Medicine.pdf 动物中的基因沉默现象是在1996年被首次发现的,当时Guo和Kemphues观察到,通过对线虫引入针对par-1 mRNA的正义链和反义链可以诱导par-1 mRNA降解。人们一开始认为这种降解是由单链RNA (ssRNA)触发的,但两年后,在1998年,Fire和Mello发现这种抑制par-1基因表达的能力实际上是由双链RNA (dsRNA)触发的。他们最终因为这项发现分享诺贝尔生理医学奖。就在Fire和Mello开创性的发现之后,Elbashir等人发现,通过使用合成的 siRNA ,可以实现对基因中特定序列,而非整个基因,的基因沉默。仅仅一年后,McCaffrey和他的同事通过在转基因小鼠中用siRNA靶向沉默了丙肝病毒的序列,证明了这种序列特异性沉默具有治疗应用。从那时起,许多研究人员一直试图扩大RNAi的治疗应用,特别是寻找导致各种类型的癌症的靶基因。在2004年,RNA干扰技术终于获准进入临床一期研究,用于治疗年龄相关的眼底黄斑病变。六年后,第一个真正的RNAi体内临床一期实验获准开展,这一次是使用纳米载体向实体瘤递送siRNA。尽管大部分RNA干扰的临床研究集中于治疗癌症方面,但RNA干扰潜在的临床应用范围十分广泛。RNA干扰技术的其他潜在临床应用包括治疗病毒 细菌 或 寄生虫感染, 纠正有害基因突变, 减少药物滥用, 缓解疼痛,甚至调节睡眠。

治疗应用

病毒性感染

抗病毒治疗是最早提出的基于RNAi的医学应用之一,并且已经开发了两种不同类型的抗病毒治疗。第一种是靶向病毒RNA。许多研究表明靶向病毒RNA可以抑制许多病毒的复制,包括HIV , HPV , 甲型肝炎, 乙型肝炎, 流感病毒,呼吸道合胞病毒,SARS冠状病毒(SARS-CoV),腺病毒和麻疹病毒。另一种策略是通过靶向宿主细胞基因来阻断最初的病毒进入细胞。例如,抑制宿主细胞上的趋化因子受体(CXCR4 和CCR5 )可以防止艾滋病毒入侵T细胞。

癌症

虽然传统的化疗可以有效地杀死癌细胞,但是化疗药物因难以区分正常细胞和癌细胞而缺乏特异性,这会导致严重的副作用。许多研究表明,RNAi可以通过靶向癌症相关基因(即癌基因)来提供更特异性的抑制肿瘤生长的方法。另外,RNAi可以增强癌细胞对化疗药物的敏感性,这提供了一种与化疗相结合的联合疗法。另一种潜在的疗法是利用RNA干扰来抑制癌细胞的浸润和转移。

神经疾病

RNA干扰也在治疗神经退行性疾病中显示出巨大潜力。通过用siRNA靶向淀粉样蛋白生成的相关基因(例如BACE1和APP)可以显著减少淀粉样蛋白的表达,而这一蛋白被认为与阿尔茨海默病有关。此外,这种基于基因沉默的疗法在治疗帕金森病和多聚谷氨酰胺疾病 (例如亨廷顿舞蹈症)方面也提供了有希望的结果。

治疗应用中的困难

为了实现RNAi的临床潜力,siRNA必须被有效地转运到靶组织的细胞中。然而,在进入临床应用之前,有各种障碍必须克服。例如,“裸”siRNA 容易受到几个降低其治疗效果的障碍的影响。此外,一旦siRNA进入血液,裸露的核糖核酸会被血清中的核酸酶降解,并刺激非特异性免疫系统。由于其尺寸和多聚阴离子的性质,未修饰的siRNA分子不能轻松地通过细胞膜进入细胞。因此,siRNA必须用人造的纳米粒子来封装 。然而,将siRNA递送到细胞膜的另一侧仍有很多特殊的困难。另外,siRNA进入细胞后,如果剂量太大可能会引发意想不到的细胞毒性,而siRNA自身也可能引发脱靶效应(敲低一些不完全互补配对的其他基因)。即便siRNA能顺利进入细胞,为维持治疗效果仍需重复给药,因为siRNA无法自我复制所以每次细胞分裂时都会被稀释。如前所述,一些递送双链RNA的载体可以具备某些调节功能。总之,在临床应用中,RNA干扰的非特异性副作用是一个必须认真考虑和解决的问题。

癌症治疗的安全性和用途

与化疗或其他抗癌药物相比,siRNA药物有很多优点。SiRNA作用于基因表达的翻译后阶段,因此不会对DNA造成有害的影响。siRNA也能通过一些途径实现一些传统化疗药物药物难以实现的特殊效应,例如解除对抑癌基因的下调。在单个癌细胞中,siRNA只需几个拷贝就能显著抑制基因表达。这一过程可以通过沉默促癌基因及其mRNA来实现。理想情况下,首先要对siRNA进行化学修饰,并通过注射给药,以便使其更有效地到达癌细胞。另外,肾脏可以选择性滤过不同尺寸的分子,这会影响siRNA在体内的吸收和利用。

免疫反应的刺激

人类免疫系统分为两个独立的部分,即非特异性和特异性免疫系统。非特异性免疫系统是人体的第一道防线,它以一种通用的方式对病原体做出响应。而另一个在进化中出现的更晚的系统,特异性免疫系统,主要由高度特异性的B细胞和T细胞组成,这些细胞被活化后可以对不同病原体的特定组分做出反应。

来自新旧病原体的刺激使人体进化出一个针对特定细胞和微粒的安保系统。这个系统使人体可以识别并消灭各种外来入侵者,例如病毒、细菌和寄生虫等。哺乳动物的安保系统将外源性RNA作为识别RNA病毒感染的重要特征,这导致人体对siRNA产生强烈的非特异性免疫反应。

siRNA引发的非特异性免疫反应包括急性炎症反应和抗病毒反应。炎症反应是由一种叫做“细胞因子”的分子介导的。这些因子包括白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)。非特异性免疫反应产生的炎症或抗病毒反应会激活模式识别受体(PRRs)。这些受体会通过识别不同病原体的特征分子(如DNA, RNA, LPS)来识别哪些病原体是病毒、细菌或真菌。不同的模式识别受体可以识别不同的结构的RNA(单链,双链,发夹结构等)。这导致siRNA更容易在人体感染病原体的情况下引发强烈的免疫反应。

作为治疗技术的前景

在2015年到2017年间,针对肝脏疾病进行的几项临床I期和II期实验表明,siRNA可以在肝脏中实现有效和持久的基因敲除,并改善临床症状,且没有太严重的毒副作用。在2018年,FDA批准了第一种siRNA药物,Onpattro, 以治疗一种罕见的基因疾病——遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性——导致的多发性神经病变。2019年,FDA批准了第二种siRNA药物,Givlaari,用于治疗另一种罕见的肝脏疾病——急性肝卟啉病。大量文献表明,体内递送系统非常有前途,并且可以根据不同需求设计非常多样化的递送系统。纳米颗粒递送系统最有前途,但这些递送系统在生产中存在过程放大方面的挑战,例如需要严格控制混合过程以获得一致的药物产品质量。下表显示了使用RNA干扰的不同药物及其在临床试验中的阶段和状态。

药物 靶标 递送方式 疾病 阶段 状态 公司 实验代码
ALN–VSP 02 KSP和血管内皮生长因子 下肢负压 实体肿瘤 i 完成 Alnylam Pharmaceuticals NCT01158079
siRNA-EphA2-DOPC EphA2 下肢负压 晚期癌症 i 招募中 安德森癌症中心 NCT01591356
Atu027 PKN3 下肢负压 实体肿瘤 i 完成 Silence Therapeutics NCT00938574
TKM–080301 PLK1 下肢负压 癌症 i 招募中 Tekmira Pharmaceuticals NCT01262235
TKM–100201 VP24,VP35,扎伊尔埃博拉L-聚合酶 下肢负压 埃博拉病毒感染 i 招募中 Tekmira Pharmaceuticals NCT01518881
ALN–RSV 01 RSV核衣壳 裸siRNA 呼吸道合胞病毒感染 ii 完成 Alnylam Pharmaceuticals NCT00658086
PRO-040201 ApoB 下肢负压 高胆固醇血症 i 终止 Tekmira Pharmaceuticals NCT00927459
ALN–PCS 02 PCSK9 下肢负压 高胆固醇血症 i 完成 Alnylam Pharmaceuticals NCT01437059
ALN–ttr 02 TTR 下肢负压 甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性 ii 招募中 Alnylam Pharmaceuticals NCT01617967
CALA-01 RRM2 环糊精纳米颗粒 实体肿瘤 i 正在进行 Calando Pharmaceuticals NCT00689065
TD101 K6a (N171K突变) 裸siRNA 先天性厚甲症 i 完成 先天性厚甲症项目 NCT00716014
AGN211745 血管内皮生长因子受体1 裸siRNA 年龄相关的视网膜黄斑变性,脉络膜新生血管 ii 终止 Allergan NCT00395057
QPI-1007 CASP2 裸siRNA 视神经萎缩,非动脉炎性前部缺血性视神经病变 i 完成 Quark Pharmaceuticals NCT01064505
I5NP p53 裸siRNA 肾损伤,急性肾衰竭 i 完成 Quark Pharmaceuticals NCT00554359
移植功能延迟,肾移植并发症 i、ii 招募中 Quark Pharmaceuticals NCT00802347
PF-655 (PF-04523655) RTP801(专有目标) 裸siRNA 脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿 i 正在进行 Quark Pharmaceuticals NCT01445899
siG12D LODER KRAS LODER聚合物 胰腺癌 ii 招募中 Silence Therapeutics NCT01676259
Bevasiranib 血管内皮生长因子 裸siRNA 糖尿病性黄斑水肿、黄斑变性 ii 完成 Opko Health NCT00306904
SYL1001 TRPV1 裸siRNA 眼部疼痛,干眼症 i、ii 招募中 Sylentis NCT01776658
SYL040012 ADRB2 裸siRNA 高眼压、开角型青光眼 ii 招募中 Sylentis NCT01739244
CEQ508 CTNNB1 大肠杆菌携带的shRNA 家族性腺瘤息肉病 i、ii 招募中 Marina Biotech 未知的
RXi-109 CTGF 自递送的RNAi化合物 瘢痕疤痕预防 i 招募中 RXi Pharmaceuticals NCT01780077
ALN-ttr sc TTR siRNA-N-乙酰半乳糖胺共价结构 甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性 i 招募中 Alnylam Pharmaceuticals NCT01814839
ARC-520 HBV的保守区 DPC 乙型肝炎病毒 i 招募中 Arrowhead Research NCT01872065
生物技术

RNA干扰已被用于生物技术,并在其他领域接近商业化。RNAi导致了新作物的发明,如无尼古丁烟草、脱咖啡因咖啡、营养强化植物和低过敏性作物。转基因北极苹果于2015年获得美国食品和药物管理局的批准。这种苹果是用RNAi沉默,使得该苹果品种在切片后不会褐变。多酚氧化酶沉默的苹果不能将绿原酸转化为正常情况下的醌类。

在作物学中,RNAi也有一些潜在的应用,例如提高作物对不良环境的耐受力或提高营养价值。RNAi可以被用来抑制光呼吸,这可以提高C3植物的光合作用效率。这种敲除技术还可用于诱导早期开花、延迟成熟、延迟衰老、打破休眠、提高植物适应性、克服自交不育等。

食品

RNAi已被用于转基因植物以降低植物中的天然植物毒素含量。这些技术利用了植物种群中稳定和可遗传的RNAi表型。棉花种子富含膳食蛋白质,但天然棉籽含有有毒的萜类产品棉酚,不适合人类食用。RNAi已被用于生产一种棉花,其种子含有低水平的δ-cadinene合酶,这是棉酚生产中的一种关键酶,而同时不影响棉酚在植物其他部分的生产,因为棉酚本身对于防止植物害虫的损害是重要的。类似的尝试也被用于减少木薯植物中的氰类天然产物芳樟素。

目前,尚没有基于RNAi改造的基因工程植物走出实验室研究阶段。在一些研究中RNAi成功地降低了番茄植物中过敏原的水平或者提高了番茄中的抗氧化膳食成分。以前的一些商品化作物,包括Flavr Savr西红柿和两种人工培育的抗环班木瓜,最初使用的是反义核苷酸技术但是很可能利用了RNAi途径。RNAi也被用于沉默玉米种的α淀粉酶以减少玉米中的黄曲霉菌生长,因为黄曲霉菌会产生致癌的黄曲霉素从而污染玉米粒。用RNAi沉默洋葱中的催泪素合成酶可以产生无泪洋葱,RNAi也被用于敲除油菜籽中的BP1基因以提高光合作用。小麦中的SBEIIa和SBEIIb基因也可以作为RNAi的靶标,以产生更高水平的直链淀粉,从而改善肠功能。

其他作物

另一项RNAi的尝试减少了烟草植物中潜在致癌物前体的产生。其他用RNAi技术在实验室中产生的新性状包括无麻醉作用的罂粟籽和对常见植物病毒的抗性。

杀虫剂

RNAi在杀虫剂中的应用正在开发中,主要途径包括对植物整体进行基因改造或直接喷洒在植物表面。一些昆虫的中肠可以通过一种被称为“环境RNA干扰”的途径吸收双链RNA分子。在一些昆虫中,RNA干扰信号可以通过全身扩散产生系统性的RNA干扰。

在动物实验中,比预期的人类暴露水平高数百万倍的RNAi杀虫剂并未产生明显的不良影响。 然而,RNAi杀虫剂有可能通过脱靶效应对生态环境中的其他生物产生影响。由于昆虫和其他许多无脊椎动物——如海绵动物、刺胞动物(如珊瑚)和线形动物的RNA干扰通路在进化上保守,针对昆虫设计的siRNA可能会影响其他物种的正常生命活动,从而对生态环境产生潜在影响。

RNA干扰在鳞翅类(如蝴蝶和飞蛾)的不同物种中有着不同的效果。迄今为止,还无法通过喂食来诱导棉铃虫、甜菜夜蛾和亚洲三化螟产生RNA干扰,这可能是因为它们的唾液和肠液更擅长分解RNA。

近年来,一些证据表明,会产生广泛的对RNA干扰的抗性,即对一种双链RNA序列产生的抗性会扩展到其他双链RNA序列。例如,在西部玉米根虫的一个实验室品种中,由于其肠道无法摄取DvSnf7的双链RNA,于是对RNA干扰产生了抗性。使用其他序列的针对DvSnf7的双链RNA同样无法有效诱导RNA干扰效应,这意味着消除这一物种中对RNAi的抗性需要一些比替换序列更复杂的策略。将多种策略结合起来,例如在RNA干扰的同时对植物引入一种来自苏云金芽孢杆菌的蛋白质Cry,可以延迟抗性的开始。

通过转基因植物递送

转基因植物也可以表达用来沉默害虫生存关键基因的dsRNA。这些双链RNA通过精心设计只影响表达特定基因序列的昆虫。为了证明这一原理的可行性,2009年的一项研究表明,可以通过转基因植物表达双链RNA,从而只杀死一种果蝇而不影响其他三种果蝇。

2012年,先正达以5.22亿美元收购了比利时的RNAi技术公司Devgen, 而孟山都则向美国的RNAi技术公司Alnylam支付了2920万美元以获得专有知识产权。位于秘鲁利马的世界马铃薯研究中心也在寻找马铃薯象鼻虫的靶基因,这种甲虫的幼虫在全球范围内破坏马铃薯。其他研究人员正试图抑制蚂蚁、毛虫和花粉甲虫的基因。第一款上市的产品可能会来自孟山都,该公司生产了一种转基因玉米种子,该种子表达可以杀死西部玉米根虫的双链RNA。西部玉米根虫是一种甲虫,其幼虫每年仅在美国就造成10亿美元的损失。2012年的一篇论文显示,沉默Snf7阻碍幼虫生长,几天内就可以杀死它们。

表面喷洒

另外,双链RNA可以不通过转基因植物直接向昆虫递送。一种方法是将它们添加到灌溉水中。双链RNA分子被吸收到植物的维管系统中,并毒害以它们为食的昆虫。另一种方法是像传统杀虫剂一样喷洒dsRNA。这种方法可以更快地适应对RNA干扰产生的抗性,但目前还不存在这样低成本的双链RNA可以用于大规模喷洒。

全基因组筛选

全基因组的RNAi筛选依赖于高通量筛选技术。基于RNA干扰的高通量筛选技术可以通过分析基因功能性缺失鉴定与特定表型相关的基因。这项技术被誉为继微阵列和单核苷酸多态性发现平台的第一次基因组学浪潮之后,潜在的第二次基因组学浪潮 。全基因组RNAi筛选的一个主要优势是它能够同时研究成千上万个基因。由于每次实验能够产生大量数据,全基因组RNAi筛选导致了产生的数据激增。如何从这么多的数据中发掘出有用的信息是一个根本性的挑战,需要合适的统计/生物信息学方法。基于细胞的RNAi筛选的基本过程包括选择RNAi文库和稳定可靠的细胞类型、用RNAi试剂转染、与RNAi试剂共培养、检测信号、分析和鉴定重要基因或治疗靶标。

历史

矮牵牛花的例子,其中色素沉着基因被RNAi沉默。左图植物为野生型;右图植物含有抑制转基因色素基因或内源色素基因表达的RNA干扰基因,导致花出现未着色白色区域。[1]

在了解RNA相关机制之前观察到的RNAi过程被称为“共抑制”和“抑制”。RNAi的发现首先是通过观察在转基因植物中表达的反义 RNA的转录抑制,而更直接的证据则来自美国和荷兰的植物学家在上世纪90年代在实验中观察到的反常现象。为了改变矮牵牛的花颜色,研究人员引入了编码查尔酮合酶的基因的额外拷贝,查尔酮合酶是导致正常粉色或紫色矮牵牛花色素沉着的关键酶。预期的实验结果是,编码查尔酮合酶基因的过表达会导致牵牛花颜色变深,然而,研究人员却观察到一些花朵的紫色依旧很浅,有时因着色不均而出现紫白相间的情况,这表明查尔酮合酶的活性受环境影响在一些花朵中被抑制或下调了。后来发现,这一现象是因为在转基因操作中,一些转基因被反向插入了启动子附近的序列中,导致这些转基因转录出刚好与原序列互补配对的反义RNA,从而导致基因沉默。RNAi的另一个早期观察来自对一种叫粉色面包霉菌的真菌的研究,尽管在当时并没有意识到这一现象与RNA干扰相关。对植物中这种现象的进一步研究表明,这种下调是由于通过增加mRNA降解导致基因表达的转录后抑制。这种现象被称为基因表达的共抑制,但分子机制在当时仍然未知。

不久之后,研究提高植物病毒抗性的植物学家们也观察到了类似的反常现象。虽然当时已经知道表达病毒蛋白的植物会对病毒感染出现抵抗力,但未曾料到只携带病毒RNA非编码区短序列的植物也会出现类似的抵抗力。研究人员发现通过转基因在植物体内表达病毒RNA也可以抑制病毒复制。将植物基因的短序列引入病毒的反向实验表明,目标基因在受感染的植物中被抑制。这种现象被称为“病毒诱导的基因沉默”(VIGS),这一组现象统称为转录后基因沉默。

在对植物进行这些初步观察后,许多实验室开始在其他生物体中寻找这种现象。 克雷格·梅洛和安德鲁·法尔于1998年在《自然》上报道了一种秀丽隐杆线虫中的强效基因沉默效应。在研究线虫肌肉蛋白质产生的调节机制时,他们观察到mRNA和反义RNA 注射都不影响蛋白质产生,但是双链RNA成功地沉默了目标基因。由于这项工作,他们创造了RNA干扰这个名词。这一发现代表了对这一现象的诱发物质的首次鉴定。Fire和Mello因此获得了2006年的诺贝尔生理医学奖。