聚合酶链式反应是什么?关于聚合酶链式反应的详细介绍

创闻科学2020-11-16 15:47:01

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种相对简单的技术和遗传学和基因组学检测工具。它可以把甚至是微量的样本中把放大到可以直接分析的程度。另外,传统的方法是将DNA序列克隆到载体上,然后在活细胞中进行复制,但这种方法通常需要几天或几周的时间,而通过PCR扩增DNA序列只需要几个小时等,所以PCR可以在短的时间内实现更灵敏的检测和更高水平的特定序列扩增。这使PCR不仅在基础研究中,而且在商业应用,包括基因鉴定、法医鉴定、工业质量控制和体外诊断等领域都发挥着重要的作用。

背景基本介绍

PCR最初被用来扩增较长DNA分子的某些片段(Saiki等,1985年)。典型的扩增反应包括靶DNA、热稳定性DNA聚合酶、两个寡核苷酸引物、脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTPs)、反应缓冲液和MgCl2。反应液配好后装入PCR管中再放入在热循环器中开始扩增(热循环器是一种使反应在设定时间内经受一系列不同温度的仪器)。其中一个系列的温度和时间循环称为一个放大周期。理论上讲,每一个PCR周期会使反应中靶序列(扩增子)的数量增加一倍。十个周期理论上约放大一千倍;20个循环,会使靶序列在几小时内增加约一百万倍。由于PCR可以实现对目标序列的扩增,所以这也可以说是一种DNA纯化技术。

PCR与诺贝尔化学奖

PCR的发明者凯利·穆利斯(Kary.B.Mullis)于1993年与迈克尔·史密斯分享了诺贝尔化学奖。此外,凯利·穆利斯还有本自传《心灵裸舞》。

PCR原理

聚合酶链反应是在一个反应混合物中进行的,该反应混合物包括DNA提取(模板DNA)、Taq聚合酶、引物,以及在缓冲溶液中过量的四种脱氧核糖核酸苷三磷酸盐(dNTPs)。PCR的过程分为三个阶段:

变性 Denaturation

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来机器就控制温度进入循环阶段。

退火或称接合 Annealing

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引子熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃,仅需时间5~10秒。

延伸 Extension

DNA聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。

碱基互补配对

DNA复制的保真性依赖于碱基互补配对原则。即A(腺嘌呤)与另一条长链上的T(胸腺嘧啶)形成氢键; 而G(鸟嘌呤)总是与C(胞嘧啶)形成氢键,即A=T、G≡C。这也是保持核酸结构的稳定的两个重要因素之一(另一个是伦敦色散力和疏水作用。)

引物设计

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。

1. 引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2. 避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3. 长度

寡核苷酸引物长度为15~30 bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。

4. G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5. 碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6. 引物自身

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7. 引物之间

两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8. 引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中,用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。

9. 引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10. 密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法。

发展及前景

应用

PCR有许多应用。这是一种现在在细胞和分子生物学中必不可少的技术。它允许,特别是在几个小时内,通过自动化系统“非细胞克隆”DNA片段,这通常需要几天的标准技术的分子克隆。另一方面,PCR被广泛用于诊断目的,以检测特定的DNA序列的存在这个或那个生物体在生物液体。它还被用来制作遗传指纹,无论是在司法调查中对一个人的遗传鉴定,还是对动物品种、植物或微生物进行食品质量检测、诊断或品种选择的鉴定。PCR仍然是进行测序或定点突变所必需的。另外还有一些关于PCR技术改良的报道例如金属有机框架辅助的高效聚合酶链式反应。

PCR变体

最后是PCR的变体,如real-time PCR, competitive PCR, PCR in - situ, RT-PCR等。

递减PCR(touchdown PCR):前几循环温度逐渐下降。

逆转录PCR(RT-PCR):以由mRNA逆转录而来的cDNA为模板,也因为是从表现型基因来进行增量的,由此产生出来的cDNA产物不带有内含子(基因中不具意义的段落),常应用于分子克隆技术。

热启动PCR(hot start PCR):以高热激活型核酸聚合酶进行反应,减少非专一性产物。

即时PCR(real-time PCR):PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测,又称定量PCR(quantitative PCR),可以进行多组对比。此次武汉新型肺炎中“核酸检测”所使用到的关键技术

巢式PCR(nested PCR):先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量,再用高特异性引物扩增。

多重PCR(multiplex PCR):在同一个管中使用多组引物。

复原条件PCR(reconditioning PCR):PCR产物稀释10倍后重新放入原浓度的引物和dNTP等循环3次,以消除产物中的异二聚体。

dsRNA合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase;从双股DNA转录为对应的双股RNA(dsRNA)。可应用于RNAi实验操作。

COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR应用技术。

Digital-PCR:将标准的PCR反应分割至每一个反应中仅1~2个copy。藉以侦测微小比例的基因差异。应用于:癌症突变基因、病原体检测、借由母血对胎儿做产前检测。